Desarrollo de métodos de detección de salmonella basados en la reacción en cadena de la polimerasa y su validación en muestras alimentarias

Abstract

Salmonella es uno de los patógenos alimentarios más importantes a nivel mundial y causante de enfermedades gastroentéricas en humanos y animales. La presencia de Salmonella en un alimento, sea en la cantidad que sea, se considera peligroso y por lo tanto no será apto para el consumo humano. Por ello, los controles microbiológicos rutinarios en la cadena alimentaria son de vital importancia para no comprometer la salud del consumidor. Los controles se deben realizar a lo largo de todo el proceso de elaboración del alimento, es decir, controlando desde las condiciones implantadas en la granja hasta la calidad del producto final que llegará al consumidor. Tradicionalmente los métodos microbiológicos empleados para detectar patógenos en los alimentos han sido métodos basados en el cultivo. El método tradicional de detección de Salmonella comprende cuatro fases: una primera fase de preenriquecimiento no selectivo, una segunda fase de enriquecimiento selectivo, un paso adicional de aislamiento en medios sólidos selectivos, y una última fase de confirmación mediante pruebas bioquímicas y serológicas. Estos procesos tradicionales de cultivo son laboriosos y alargan la obtención de los resultados hasta una semana. Las técnicas moleculares han sido un gran avance de las cuales la microbiología se ha beneficiado para desarrollar métodos nuevos de detección de patógenos. Entre ellas, las técnicas basadas en la amplificación de los ácidos nucleicos como la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) proporcionan una estrategia rápida y sensible para la detección de patógenos. Además, la mejora que ha supuesto la PCR a tiempo real permite obtener los resultados incluso en menos tiempo y evitar el procesado post-PCR que puede provocar contaminación cruzada debido a la manipulación de las muestras. En todo caso, para el desarrollo de métodos basados en PCR es esencial la elección de una diana genética adecuada a cada patógeno que permita diseñar técnicas totalmente específicas de la bacteria que se quiera detectar en cada caso. El objetivo principal de este trabajo fue crear métodos de detección de Salmonella basados en la PCR que facilitasen y disminuyesen el tiempo requerido para la obtención de los resultados. Para ello se cumplieron las siguientes etapas: i) elección de una diana genética específica de Salmonella, ii) desarrollo de una PCR para el diagnóstico de Salmonella, iii) desarrollo de sistemas de PCR a tiempo real para detección de Salmonella, iv) validación de los métodos de PCR a tiempo real diseñados frente al método tradicional de detección de Salmonella en muestras de alimentos. En primer lugar se estudiaron diferentes genes propuestos por diversos autores como dianas genéticas de Salmonella. Tras realizar diversas reacciones de PCR con las parejas de iniciadores correspondientes, se estableció que el gen más adecuado para utilizar como diana genética de Salmonella en métodos de PCR era el gen invA. La proteína codificada por este gen pertenece a un sistema de secreción totalmente necesario para causar la invasión bacteriana de las células epiteliales del intestino. Al ser un gen involucrado con la virulencia de Salmonella, presuntivamente estará en todos los aislamientos de Salmonella, o por lo menos, en todas las cepas virulentas. Una vez elegido el gen invA como diana genética específica de Salmonella se diseñó una PCR, utilizando los mismos iniciadores descritos anteriormente por Rahn K y colaboradores (1992), a la cual se añadió un control interno de amplificación diseñado específicamente en este trabajo. La incorporación de controles internos de amplificación a los métodos de PCR es esencial para detectar posibles inhibiciones en las reacciones de PCR, causadas principalmente por componentes presentes en los alimentos. Las 40 cepas de Salmonella analizadas mediante esta PCR mostraron un resultado positivo para la amplificación del gen invA, mientras que todos los aislamientos analizados de microorganismos relacionados con esa bacteria fueron negativos. Con la intención de disminuir aun más los tiempos de obtención de resultados, se decidió adaptar esa PCR a un formato de PCR a tiempo real. Existen diferentes sistemas de detección utilizados en PCR a tiempo real. En este trabajo se eligió diseñar por un lado una PCR utilizando sondas TaqMan® como sistema detección, y por otro lado una PCR a tiempo real utilizando SYBR Green I. En la PCR a tiempo real con SYBR Green I los iniciadores utilizados fueron los mismos que para la PCR convencional, pero se diseñó un nuevo control interno adecuado para la PCR a tiempo real. Sin embargo, para la PCR a tiempo real con sonda se diseñaron unos nuevos iniciadores y una sonda que hibridase específicamente con el fragmento amplificado por esos iniciadores, además de un nuevo control interno que fuese detectado mediante otra sonda adicional marcada con un fluoróforo diferente. La especificidad de ambas reacciones de PCR a tiempo real fue probada tanto de forma teórica mediante programas informáticos como de manera experimental. La tecnología con sondas TaqMan® resultó ser más sensible que la tecnología SYBR Green I en este estudio, aunque por otro lado, la ausencia de reacción de la sonda con una de las cepas de Salmonella analizadas indicó que esa tecnología era a su vez menos específica que el SYBR Green I. Los métodos de PCR a tiempo real fueron comparados frente al método tradicional de detección de Salmonella en diferentes muestras de alimentos. Para realizar esta validación se siguió lo descrito en la norma ISO 16140:2003. Se calcularon tanto la inclusividad y exclusividad de los métodos, así como la eficacia relativa, especificidad relativa y sensibilidad relativa de los métodos moleculares, y también el nivel de detección relativa de éstos. En la PCR a tiempo real con sonda TaqMan® se utilizaron dos master mix comerciales diferentes (una master mix de Takara y otra de Applied Biosystems) con el fin de analizar también la influencia que ejerce la master mix empleada en los resultados. Para el cálculo de la inclusividad se utilizaron 50 aislamientos diferentes de Salmonella según lo indicado en la citada norma ISO, obteniendo para todos ellos un resultado positivo para la detección del gen invA. Para el test de exclusividad se analizaron 30 cepas de microorganismos relacionados con Salmonella, los cuales mostraron un resultado negativo en las reacciones de amplificación. Para el cálculo de la eficacia, especificidad y sensibilidad relativas se utilizaron 309 muestras de alimentos diferentes según las categorías alimentarias descrita en la norma ISO. Para obtener una amplia variedad de resultados positivos y negativos, aproximadamente la mitad de esas 309 muestras de alimentos fueron contaminadas artificialmente con Salmonella. Se obtuvieron unos valores comprendidos entre 80%-100%, excepto en la sensibilidad relativa de la PCR a tiempo real con sonda utilizando la master mix de Applied Biosystems que fue del 62,4%. Los niveles de detección relativa se calcularon según lo descrito en la norma ISO para cinco alimentos diferentes (uno de cada categoría alimentaria), utilizando para cada alimento 5 o 6 niveles de contaminación. Los resultados obtenidos abarcaron un rango de 0,1-10 células/25gr de alimento. Excepto en la PCR a tiempo real con sonda en la cual el límite de detección en muestras de pescado fue de alrededor de 100 células/25gr. A lo largo de todo el análisis realizado en alimentos se identificaron diferentes etapas que se consideraron críticas a la hora de emplear métodos moleculares para la detección de patógenos en alimentos. Uno de los principales problemas surgidos fue la influencia que ejercía la composición del alimento a lo largo de todo el proceso. Los mayores problemas se detectaron en los alimentos con un alto contenido en grasa, dado que la grasa influye notablemente en la capacidad de detección de los métodos moleculares. Otro de los puntos críticos fue el método de extracción de ADN, que puede influir en la concentración del ADN recuperado y en su calidad. Por todo ello, y al no existir un protocolo universal de procesamiento de las muestras previo a las reacciones de PCR, se debe optimizar cada método de análisis teniendo en cuenta el alimento que se debe analizar y el patógeno que se quiere detectar, y amoldarlo a las circunstancias especiales de cada laboratorio