Structure and dynamics of a membrane symporterThe Melibiose Permease

  1. Ravi Madapusi, Vidhya
Dirigida per:
  1. Esteve Padrós Morell Director/a
  2. Josep Cladera Cerdà Director/a

Universitat de defensa: Universitat Autònoma de Barcelona

Fecha de defensa: 30 de de març de 2016

Tribunal:
  1. Francesc Sepulcre Sánchez President/a
  2. Rubén Ruiz González Secretari/ària
  3. Jordi Hernández Borrell Vocal

Tipus: Tesi

Teseo: 407059 DIALNET lock_openTDX editor

Resum

L’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral ha estat estudiar el mecanisme de simport de la permeasa de melibiosa, MelB, un transportador secundari d’Escherichia coli, utilitzant mètodes experimentals (fluorescència, infraroig, assajos de transport) i computacionals (simulacions de dinàmica molecular). La MelB és un exemple de transportador versàtil, que pot utilitzar tant protons, com ions sodi o liti per a transportar una varietat de sucres ? i ? galactòsids. La MelB és una proteïna de 473 aminoàcids estructurats en forma de 12 hèlix transmembrana amb un 70% de residus hidrofòbics. Alguns estudis anteriors han demostrat que els bucles citoplasmàtics de la proteïna són importants per a la seva funció. Per tal d’avaluar la importància dels bucles perimplasmàtics, en el present treball hem analitzat el paper del bucle perimplasmàtic 5-6 (ric en glicines), juntament amb el paper d’uns pocs residus als extrems de les dues hèlix que connecta el bucle, la V i al VI, per mutagènesi dirigida. Els experiments de fluorescència (FRET) i d’infraroig (FTIR) han demostrat que les mutacions puntuals produeixen un efecte intermedi (50%) en la unió de substrats al transportador, exceptuant (i) els mutants Asp35 i Arg175/Asp35, que no uneixen substrat i (ii) els mutants Asn168 (bucle 5-6) i Phe177 (hèlix VI), que afecten en un grau elevat (més del 50%) la unió dels substrats. L’aproximació computacional ha permès concloure que alguns residus, com la Leu164 (hèlix V), l’Asn168 i la Phe177 juguen un paper important en el manteniment de la forma parcialment oclosa, interaccionant amb la meitat C-terminal de la proteïna. A més també s’han analitzat el paper de les interaccions iòniques. La informació obtinguda dels estudis de dinàmica molecular s’ha enriquit a partir de la troballa i descripció, per primera vegada, d’una forma de la proteïna oberta a l’exterior, resultat d’una trajectòria de 250 ns a partir de l’estructura cristal·logràfica. Els resultats indiquen que els residus Asp35, Asn168 i Phe177 tenen un paper important en el mecanisme de transport de la permeasa de melibiosa d’E. Coli.