Detección de residuos y fraudes en alimentos. Ventajas de su análisis mediante sistemas bajo observación indirecta

Zusammenfassung

La detección de residuos procedentes de tratamientos veterinarios y de fraudes alimentarios es un tema de interés permanente que obliga a mantener una mejora continua en los procedimientos de análisis. En el primer caso, dado que muchas de esas sustancias son potencialmente peligrosas para la salud, la Comisión de la Unión Europea ha reglamentado los requisitos de funcionamiento de los métodos analíticos para su identificación y cuantificación. Esta normativa se recoge en la Decisión 2002/657/CE que es de obligado cumplimiento en los estados miembros de la U.E. En el sexto considerando, la Decisión establece que: Los avances realizados en química analítica desde la adopción de la Directiva 96/23/CE han dejado obsoleto el concepto de métodos de rutina y métodos de referencia y lo han reemplazado por un planteamiento en el que se establecen criterios de funcionamiento y procedimientos de validación de los métodos de cribado y confirmación y declara anuladas las Directivas que establecieron métodos de referencia para la determinación de metales pesados, arsénico, sustancias de efecto hormonal y tireostático y residuos de tratamientos veterinarios o farmacológicamente activos. Este punto elimina cualquier barrera para utilizar señales analíticas de orden uno o superior (vectores, matrices, tensores, etc.) junto con calibrados multivariantes en la identificación y cuantificación de esas sustancias, siempre que se proceda a la validación de los métodos analíticos conforme a lo dispuesto en la propia Decisión, que se enmarca sistemáticamente en el contexto de la norma ISO. En el caso de los fraudes alimentarios de tipo esencialmente económico se trata de determinar la presencia de materias primas que, o no debieran formar parte del producto elaborado o bien están en una proporción no registrada debidamente en el etiquetado. Ambos aspectos han sido tratados en esta Tesis Doctoral desde el punto de vista de la observación indirecta de sistemas. Esta expresión fue acuñada por H. Cramer para la Conferencia que se celebró del 18 al 20 de octubre de 1979 en Cartigny (Suiza) y en la que H. Wold y K.G. Joreskog presentaron los modelos matemáticos basados en variables latentes PLS (Partial Least Squares) y LISREL (Linear Structural Relations). El título completo -Systems under indirect observation : causality, structure, prediction- es toda una declaración de metodología experimental a utilizar. Siguiendo la trayectoria analítica anterior y añadiendo una característica más, que tienen algunas técnicas multivariantes como el Análisis Factorial Paralelo (PARAFAC), conocida como -propiedad de segundo orden', en esta Tesis se muestra la viabilidad de utilizar la señal de fluorescencia (señales de orden uno o dos) junto con calibrados PLS o PARAFAC para obviar los problemas de no especificidad y la dependencia del medio (efecto amortiguamiento o quenching') que tiene la fluorescencia cuando se analizan matrices complejas. En el contexto de las determinaciones reguladas, como es el caso de la Decisión 2002/657/CE, el mayor problema para su uso analítico es que en muestras complejas pueden coexistir otras sustancias también fluorescentes, de modo que se ha de recurrir a complejas etapas previas de extracción y/o cromatografía. Precisamente, al considerar tensores de datos en vez de matrices, en la memoria se evidencia cómo la estructura química latente, al ser identificada sin ambigüedad, permite hacer calibrados y optimizar con señales globalmente no específicas. La consideración de sistemas observables de modo indirecto' es la que confiere todo el potencial analítico a la espectroscopia de fluorescencia, que por otro lado es una técnica sencilla, barata y con una buena relación señal/ruido. Otro tanto ocurre con la detección de fraudes en el uso de las materias declaradas en el etiquetado. Se puede recurrir a detectar las señales específicas del producto en estudio, lo que supone tratar la muestra de modo que se pueda disponer de una señal específica para cada uno de los componentes de la mezcla. Por ejemplo, si se requiere el uso de una técnica cromatográfica, sería necesario identificar y cuantificar los picos cromatográficos específicos de los distintos constituyentes. Frente a este modo de proceder es mucho mas eficiente la identificación, por ejemplo mediante señales de orden uno y análisis en componentes principales, para después cuantificar con una regresión PLS y establecer las probabilidades de falsa no conformidad (rechazar indebidamente un producto correcto) y falsa conformidad (aceptar indebidamente un producto inadecuado). De nuevo la consideración de la muestra como sistema bajo observación indirecta, es decir la utilización de un perfil cromatográfico sin necesidad de especificidad en los picos elegidos, es el concepto clave para obtener la máxima información de los datos proporcionados por el método analítico. El trabajo consta de diez capítulos además de la introducción. En primer lugar, se recogen los problemas comúnmente encontrados cuando se realizan determinaciones análiticas basadas en la espectroscopia molecular de fluorescencia de exitación-emisión y se trabaja con muestras complejas. Se hace una revisión bibliográfica y se constata el aumento considerable de los trabajos en los que se utiliza la espectroscopia de fluorescencia molecular, junto a PARAFAC, desde hace unos pocos años. A continuación, se revisan conceptos relacionados con figuras de mérito definidas en la Decisión 2002/657/CE, y su adaptación a modelos multivariantes-multivía. Estas figuras de mérito son: el limite de decisión, la capacidad de detección, la exactitud y sus dos componentes la precisión y la veracidad, la robustez, la capacidad de discriminación multivariante y las probabilidades de error relacionadas con estas figuras de mérito. Todos estos parámetros se revisan, en un contexto multivariante, ya que se utilizarán luego a lo largo de toda la memoria tanto en los métodos cuantitativos como en los métodos de cribado puestos a punto. También se hace una breve revisión de las técnicas de descomposición, como componentes principales (PCA) y el análisis factorial paralelo (PARAFAC), y de los modelos de regresión multivariante basados en variables latentes, ya sea PLS o aquellos que utilizan como señal los loadings muestrales de una descomposición PARAFAC. Se revisa cómo debe aplicarse esta metodología en el campo de la espectroscopia de fluorescencia y de la cromatografía, y se pone de manifiesto la enorme ventaja de la utilización de la propiedad de segundo orden para identificar inequívocamente los analitos. Asimismo, se ponen de manifiesto las ventajas del bajo coste, la rapidez y la capacidad de detección de estas técnicas. En la primera de las aplicaciones, se analiza el efecto que tiene el uso de sustancias que potencian la señal fluorescente, como es caso de algunos cationes divalentes, sobre las figuras de mérito de los métodos analíticos. Se realiza el estudio no sólo para modelos con calibrados multivariantes sino también para aquellos modelos construidos a partir de los mismos datos experimentales pero con un calibrado univariante. A continuación, se diseña una estrategia experimental ad-hoc', consistente en obtener distintos niveles de dilución de suero de leche, que permite determinar la tetraciclina en este suero incluso en presencia de interferentes. Previamente, mediante un diseño D-óptimo llevado a cabo se comprueba que la señal de fluorescencia deja de ser trilineal cuando en la matriz existen ciertos cationes divalentes, que se encuentran habitualmente en la leche. La información incorporada en los datos experimentales a través de la dilución permite concluir el análisis con éxito. El efecto que el amortiguamiento (quenching') tiene sobre las determinaciones que se realizan es quizás el problema más complejo de los planteados en la memoria ya que el cambio provocado en el rendimiento cuántico únicamente modifica la magnitud de la señal espectral y no su forma. Esto hace que sea necesario recurrir a utilizar una nueva vía, la cuarta, para poder abordar el problema. También se lleva a cabo un estudio de robustez para un procedimiento analítico de determinación de tetraciclina en leche en presencia de clortetraciclina, lo que hace necesaria la utilización de modelos basados en calibrados de tres vías. La eficiencia de un diseño de cribado Plackett-Burman para el análisis de la robustez de siete factores experimentales, se estudia a lo largo del trabajo, quedando patente que para este tipo de análisis no es suficiente con tomar como respuesta del diseño de experimentos la señal fluorescente, sino que es necesario considerar la concentración calculada con la técnica multivariante. Los métodos de cribado de sulfamidas en leche, mediante un sistema bajo observación indirecta con espectroscopia de fluorescencia frontal es otro de los temas abordados en esta memoria, dónde no sólo se pone a punto el método de cribado sino que además se evalúa el riesgo de falsa no conformidad y falsa conformidad para una mezcla de seis sulfamidas añadidas a varias marcas comerciales de leche distintas. La rapidez de esta técnica que permite la medida directa de la leche intacta, sin más que añadir el derivatizante que induzca la fluorescencia a la muestra, hace del procedimiento una alternativa real a los métodos actuales basados, muchos de ellos, en análisis microbiológicos, sobre todo para alguna de las sulfamidas donde éstos no llegan a discernirla a los niveles del límite permitido (100 ¿g Kg-1). Finalmente, se aborda la detección de fraudes de tipo legal debidos a la no coincidencia del etiquetado de un producto alimentario con el porcentaje de los distintos componentes en una mezcla, mediante el uso de modelos basados en variables latentes como PCA y PLS y medidas procedentes de un perfil cromatográfico no específico. Además, se propone toda una metodología sustentada en método de mínimos cuadrados parciales (PLS) que además proporciona la sensibilidad y especificidad del modelo construido para detectar porcentajes de leche de distinto tipo en leche envasada y queso ya elaborado.