Nuevas metodologías analíticas por page-la-icp-ms en la caracterización de muestras biológicas y orgánicas de interés medioambiental

Résumé

El objetivo de esta tesis ha sido el desarrollo de metodología basada en Electroforesis sobre Gel de Poliacrilamida (PAGE) y Ablación Láser-Plasma de Acoplamiento Inductivo-Espectrometría de Masas (LA-ICP-MS) para llevar a cabo la especiación de metales asociados a proteínas y a materia orgánica natural. Este objetivo general se puede dividir en tres partes: - Se ha estudiado cómo diferentes parámetros relacionados con el proceso electroforético de separación, como la naturaleza del mismo (desnaturalizante o nativo), el ión de arrastre utilizado (glicina o tricina), la intensidad aplicada y los procesos posteriores de tinción, influían en los enlaces metal-proteína, llevando a cabo la determinación de los metales en las bandas de proteínas en el gel mediante LA-ICP-MS. Para ello se han empleado tres proteínas con diferentes afinidades metal-proteína: Superóxido Dismutasa (SOD) (una metaloproteína que contiene Cu y Zn), Alcohol Deshidrogenasa (ADH) (proteína que enlaza Zn) y Tiroglobulina (Tg) (que no contiene un metal, sino un heteroátomo, I, y fue escogida por la fortaleza de este enlace). Se ha observado que en el caso de proteínas que contienen heteroátomos (como la Tg), el enlace con la proteína es lo suficientemente estable como para mantener su integridad durante el proceso, incluso en condiciones desnaturalizantes, lo que permite la posterior determinación cuantitativa por LA-ICP-MS. Para algunas metaloproteínas (como la SOD), el uso de tricina como ión de arrastre, aún en condiciones desnaturalizantes, permite preservar el enlace metal-proteína. Sin embargo, para proteínas cuyas interacciones metal-proteína son de menor afinidad (como la ADH), es necesario el uso de condiciones desnaturalizantes y de tricina para preservar el enlace durante el proceso. En general, cuanto mayor es la intensidad aplicada, mayor es la posibilidad de que se pruduzca pérdida de enlaces metal-proteína. Es mejor evitar los procedimientos de tinción porque pueden alterar la estabilidad de los complejos metal-proteína. - Se han llevado a cabo la especiación de metales asociados a materia orgánica natural, en concreto a ácidos húmicos y lixiviados procedentes de una muestra de compost por PAGE-LA-ICP-MS. Para ello, se ha optimizado el proceso de separación por electroforesis de estas muestras, empleándose técnicas de electroforesis en una dimensión (1D-PAGE), isoelectroenfoque (IEF) y electroforesis bidimensional (2D-PAGE). La aplicación de estas separaciones ha permitido caracterizar las fracciones orgánicas de este tipo de muestras. Se han utilizado con éxito por primera vez poliestirensulfonatos de sodio (PSS) para determinar los pesos moleculares de las fracciones de ácidos húmicos obtenidas tras la separación electroforética. Los resultados obtenidos han sido similares a los obtenidos mediante Cromatografía de Exclusión Molecular. Tras la separación, la detección de los metales asociados a las distintas fracciones obtenidas por LA-ICP-MS ha permitido conocer qué metales eran movilizados por las distintas fracciones previamente caracterizadas por 1D-PAGE (basada en un sistema Tris-Borato), IEF y 2D-PAGE. - En la última parte se ha llevado a cabo la especiación de metales asociados a proteínas en plancton por PAGE-LA-ICP-MS. Para ello se ha optimizado el método de extracción de proteínas de una muestra certificada de plancton y los procesos de preconcentración y purificación de las mismas, para obtener no sólo la máxima eficiencia en la extracción de proteínas, sino también de los metales potencialmente unidos a ellas, y tratando de mantener la integridad del enlace metal-proteína. A continuación, se han optimizado los métodos electroforéticos de separación, tanto en una dimensión como por isoelectroenfoque para separar estas proteínas. Mediante la separación por 1D-PAGE ha sido posible separar las distintas proteínas presentes en la muestra certificada de plancton tras su extracción y preconcentración, pudiendo caracterizarlas por sus pesos moleculares. La posterior detección de metales por LA-ICP-MS ha permitido observar cómo los distintos metales se asocian a distintas fracciones de proteínas en la muestra de plancton estudiada.