Inmunosensores amperométricos y espectrofotométricos para la determinación de fumonisina b1 en cereales. Desarrollo de un kit portátil y de una plataforma microfluídica

Zusammenfassung

Introducción La elevada toxicidad de las micotoxinas y su presencia en una gran variedad de alimentos está teniendo un alto impacto social en los últimos años [1]. Esta elevada toxicidad incluye riesgos muy graves, como genotoxicidad, efectos cancerígenos, daños en múltiples órganos, inmunosupresión y muchos otros, que se manifiestan en concentraciones de muy pocos µg kg-1. Por este motivo, todos los países económica y socialmente desarrollados (incluyendo los de nuestro entorno y los pertenecientes a la Unión Europea) desarrollan reglamentaciones muy estrictas y establecen límites máximos de concentración cada vez más pequeños en los diferentes tipos de alimentos [2-4]. El reglamento (CE) nº 1126/2007 de la Comisión de 28 de septiembre de 2007 fija el contenido máximo de determinados contaminantes en los productos alimenticios por lo que se refiere a las toxinas de Fusarium en el maíz y los productos del maíz. En la actualidad se han armonizado en la Unión Europea los contenidos máximos admitidos de fumonisinas en maíz y derivados [4], aplicables a partir del 1 de octubre de 2007. Los efectos toxicológicos de las fumonisinas están relacionados con enfermedades en los animales tales como la leucoencefalomalacia equina y el edema pulmonar porcino, y con el cáncer esofágico en seres humanos [5]. La FB1 es un posible cancerígeno para humanos (Grupo 2B del IARC, 2002) y debido a su presencia en alimentos y piensos existe una exposición humana y animal que habría que reducir al máximo, siendo el maíz el alimento más susceptible a la formación de fumonisinas. Memoria El objetivo general del trabajo ha sido el diseño, optimización y desarrollo de un biosensor espectrofotométrico y electroquímico de afinidad para la determinación de FB1 basado en la inmovilización de anticuerpos, con transducción amperométrica que pueda ser aplicado e integrado en una instrumentación portátil para su uso en controles analíticos in situ por personal no especializado, en el ámbito alimentario (principalmente cereales y derivados). Se han estudiado y desarrollado esquemas de identificación bioquímica específica e inmovilización de las fases biorreactivas sobre un electrodo serigrafiado de carbono (SPCEs) para llevar a cabo la inmovilización del anticuerpo monoclonal para la FB1 sobre las micropartículas magnéticas, soporte de la reacción de biorreconocimiento. Se han estudiado distintas fases de biorreconocimiento de varias casas comerciales para escoger el que mejores propiedades de afinidad, cinética y reactividad cruzada ofrecía. Se ha optimizado la transducción amperométrica sobre SPCEs utilizando los electrodos serigrafiados de varios tipos para su comparativa y posterior elección para el sensor electroquímico final. Se han estudiado varios sustratos en la fase final del ensayo, en concreto en la transducción de la reacción electroquímica. Se ha optimizado el biosensor mediante técnicas espectrofotométricas: Utilización de la técnica ELISA, acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay para la optimización de los reactivos de biorreconocimiento. Se han validado los inmunosensores espectrofotométricos y electroquímicos mediante comparación de sus resultados con muestras estándares certificadas y con métodos oficiales de análisis de FB1. El inmunosensor electroquímico para la determinación de FB1 se ha optimizado para su uso a nivel comercial. Se deben establecer perfectamente el número y volumen de reactivos a emplear, así como las fases y tiempos del proceso y las instrucciones específicas del sensor electroquímico comercial para la determinación de esta toxina. Además ha sido necesario realizar la validación del inmunosensor electroquímico de FB1 con la metodología oficial de análisis, en este caso cromatografía líquida de alta resolución mediante derivatización previa de la micotoxina y detección por fluorescencia (HPLC-FLD) [6-9]. Además con esta técnica se han realizado estudios de diferentes posibilidades de extracción de las muestras alimentarias (harinas de trigo o maíz), e incluso de extracciones conjuntas de varias micotoxinas de la misma familia en una misma muestra de alimento. Se ha iniciado el desarrollo de una plataforma microfluídica. Como fase final de esta tesis doctoral, se ha pretendido la posibilidad de automatizar de una forma rápida y con un menor consumo de reactivos este sensor. Para ello se ha diseñado un chip de microfluídica. Las reacciones de biorreconocimiento, las etapas del ensayo y los procedimientos han sido exactamente los mismos que en el sensor electroquímico inicial, pero acoplados a un sistema operativo portátil que automatizaría todas las fases del proceso. Resultado En esta Tesis Doctoral se han desarrollado de forma paralela un inmunosensor espectrofotométrico (mpELISA) y un inmunosensor electroquímico (amperométrico) para la determinación de fumonisina B1 (FB1), que utilizan partículas magnéticas en su esquema de ensayo como soporte sólido para la reacción de biorreconocimiento. Además se realizó la validación de ambos sensores con materiales de referencia certificados y con la técnica oficial AOAC de cromatografía líquida de alta resolución. Los métodos que se han desarrollado para ambos inmunosensores cumplen los criterios de validación establecidos por la legislación Europea para ser considerados métodos oficiales de análisis para la micotoxina FB1 en cereales. También se ha realizado la extracción conjunta y determinación de las micotoxinas FB1 y deoxinivalenol (DON), y los primeros estudios de automatización del inmunosensor de FB1 mediante una plataforma microfluídica. Se detallan a continuación las conclusiones más importantes de esta Tesis Doctoral: - La caracterización del conjugado FB1-HRP sintetizado con los reactivos SAMSA y EMCS mostró la escasa reactividad de la FB1 conjugada con esta estrategia de unión, así como la imposibilidad de conocer claramente cuál era la relación exacta de FB1 respecto a la enzima HRP en el conjugado enzimático. - La caracterización del conjugado FB1-HRP comercial (Europroxima, 5121FUM) mostró las buenas propiedades de biorreconocimiento de la FB1 conjugada de este modo, así como el mantenimiento de las propiedades enzimáticas de la peroxidasa en el ensayo. - La afinidad del aptámero de la FB1 (Biomedal, IBA) tanto a la micotoxina como a los distintos conjugados enzimáticos estudiados mediante resonancia de plasmón superficial fue muy baja, aun empleando las mismas condiciones experimentales que las utilizadas en su proceso de selección. La inmovilización del aptámero al chip CM5 se realizó tanto de forma directa como mediante la interacción biotina-avidina, obteniéndose con ambos métodos una afinidad insuficiente a la FB1 y a los distintos conjugados enzimáticos de FB1. -La afinidad estudiada entre el aptámero y la FB1 mediante ELONA espectrofotométrico convencional puso de manifiesto la escasa actividad de biorreconocimiento existente entre el aptámero y la FB1, ya que las absorbancias no respondían a ningún cambio en las concentraciones ensayadas. Con la técnica ELONA, utilizando MBs, se obtuvieron uniones no específicas muy elevadas en comparación con las propias de la reacción de biorreconocimiento. El esquema de ensayo indirecto no funcionó correctamente debido a la escasa afinidad del AptFB1-bi al conjugado enzimático y a la alta señal inespecífica del ensayo. No obstante, el uso de partículas magnéticas sí que produjo mejores resultados, al evitarse impedimentos estéricos en el plegamiento del aptámero en su unión con las moléculas diana derivadas de la FB1, produciendo una mayor afinidad. - Los resultados de afinidad del aptámero hacia la FB1 que se obtuvieron por técnicas electroquímicas (CRA y DPV), absorción molecular UV-Vis y resonancia de plasmón superficial fueron poco satisfactorios. Por ello, y teniendo en cuenta los buenos resultados de afinidad empleando anticuerpos, se decidió descartar el aptámero de FB1 como vía de desarrollo de un aptasensor de FB1 en esta Tesis Doctoral. - La afinidad entre el anticuerpo monoclonal de FB1 clon Cov2A2 (Covalab) y la FB1 no fue suficiente para el desarrollo del inmunosensor de FB1, como quedó comprobado en los estudios realizados por absorción molecular UV-Vis y resonancia de plasmón superficial, comprobando su escasa afinidad por esta micotoxina y por sus conjugados enzimáticos. - La afinidad, la especificidad y la competición con el anticuerpo monoclonal de FB1 clon IC9 (mAbFB1, R-Biopharm) resultó satisfactoria, como quedó demostrado en los estudios realizados empleando las técnicas ELISA convencional y mpELISA. Se concluyó que las uniones producidas entre el mAbFB1 y el conjugado FB1-HRP se debían exclusivamente a la reacción de biorreconocimiento antígeno-anticuerpo, permitiendo una competición adecuada frente a la concentración de FB1 en el inmunoensayo. - Para la inmovilización del elemento de biorreconocimiento se emplearon varios tipos de MBs con distintas funcionalizaciones. Las partículas magnéticas funcionalizadas con proteína G (MBs-prG) resultaron las óptimas como soporte sólido para la inmovilización del anticuerpo mAbFB1 clon IC9. El tiempo de vida del mAbFB1 inmovilizado sobre las MBs-prG fue de 33 días almacenado a 4 °C. - El mAbFB1 clon IC9 presentó una buena selectividad para la FB1 y una baja afinidad por otras micotoxinas. La reactividad cruzada del mAbFB1 con el DON fue del 6,2%, con la OTA del 7,0% y con la OTB del 5,6%. - Se optimizaron las condiciones experimentales finales para el inmunosensor espectrofotométrico de FB1: 5µg de MBs-prG, 10 mg L-1 de mAbFB1, dilución 1:200 conjugado FB1-HRP, rango de concentraciones de FB1 de 0-100 ng mL-1, tiempo de competición de 30 minutos, temperatura del ensayo de 25 °C, 3 etapas de lavado con 300 µL de PBS 0,1M, ausencia de bloqueo inicial de la placa ELISA, agitación orbital durante la competición, tiempo de reacción enzimática de 20 minutos, TMB como sustrato enzimático y medida de absorbancia molecular a 450 nm. - El calibrado del inmunosensor espectrofotométrico de FB1 obtenido bajo las condiciones experimentales óptimas presentó unos parámetros analíticos del ajuste 4-PL satisfactorios, con descensos de señal en la competición por encima del 90% y coeficientes de regresión próximos a la unidad. - El valor medio del EC50 obtenido durante 12 meses con el inmunosensor mpELISA espectrofotométrico fue de 2,40 ± 0,43 ng mL-1 de FB1. Este valor puede oscilar entre 1-4 ng mL-1 de FB1. - La extracción de la FB1 en las muestras de cereales se realizó con una mezcla de los disolventes de MeOH:H2O, 70:30 (m/v) y agitando por volteo durante 30 minutos. Estos extractos se mantienen estables durante 1 semana almacenados a 4 °C. - Los porcentajes de metanol (entre el 0,7 y el 7%) resultantes de la etapa de extracción de la FB1 de las muestras de cereales y presentes durante la medida final, tanto espectrofotométrica como electroquímica, no producen un efecto nocivo en la competición, puesto que el biorreconocimiento entre el mAbFB1 y la FB1 o FB1-HRP se produce de forma satisfactoria, con unos porcentajes de descenso de señal en la competición próximos al 90%. - Se optimizaron las condiciones experimentales finales para el inmunosensor electroquímico de FB1: 5µg de MBs-prG, 10 mg L-1 de mAbFB1, dilución 1:200 conjugado FB1-HRP, rango de concentraciones de FB1 de 0-100 ng mL-1, tiempo de competición de 30 minutos, temperatura del ensayo de 25 °C, 3 etapas de lavado con 300 µL de PBS 0,1M, ausencia de bloqueo inicial de la placa ELISA, agitación orbital durante la competición, tiempo de reacción enzimática de 10 minutos, HQ y TMB como posibles sustratos enzimáticos y potencial de trabajo de -0,35V para la HQ y -0,2V para el TMB. - El calibrado del inmunosensor electroquímico de FB1 obtenido bajo las condiciones experimentales óptimas también presentó unos parámetros analíticos del ajuste 4-PL satisfactorios, con descensos de señal en la competición por encima del 85% y coeficientes de regresión próximos a la unidad (regresión no lineal, nivel de confianza del 95%). - El valor medio del EC50 obtenido con el inmunosensor electroquímico fue de 2,29 ± 0,44 ng mL-1 de FB1 con HQ como mediador electroquímico (durante 14 meses) y 2,24 ± 0,48 ng mL-1 de FB1 con TMB como mediador electroquímico (durante 9 meses). Estos valores pueden oscilar entre 1-4 ng mL-1 de FB1. - Se estudiaron dos posibles vías de la medida electroquímica utilizando la detección amperométrica (AD): el modo alternado y el modo consecutivo. En la primera (AD-a) se toman las corrientes de los 8 sensores cada 0,24 s durante los 90 s de medida, y en la segunda (AD-c) se mide durante 90 s cada sensor uno detrás del otro. Se escogió el modo alternado (utilizando la configuración 1) como forma de medida, aunque durante el estudio se observó una ligera mejor reproducibilidad con el modo consecutivo. Se decidió escoger el modo alternado al resultar asumible su reproducibilidad intrínseca, en comparación con el aumento del tiempo final del ensayo al ser la medida con el modo consecutivo de forma secuencial. Los calibrados de FB1 obtenidos fueron similares para ambos modos de medida (EC50 de 3,68 y 3,20 ng mL-1 de FB1 para AD-a y AD-c respectivamente), si bien la intensidad de corriente obtenida se incrementó con el uso del modo alternado debido a la aparición de una corriente capacitativa sin influencia en los resultados. - Se estudiaron dos posibles vías de sustratos enzimáticos en el inmunosensor electroquímico, la HQ y el TMB. Ambos sustratos ofrecieron resultados muy satisfactorios y estadísticamente comparables con una probabilidad del 95%. El TMB presenta una mayor estabilidad en disolución y es un único reactivo frente al conjunto HQ y H2O2. La disolución de HQ es necesario prepararla justo antes de su uso a partir de alícuotas congeladas, por lo que requiere un tiempo de preparación mucho mayor que el TMB, que se utiliza directamente sin necesidad de preparación previa. - Los estudios de reproducibilidad de los electrodos CH8 (Italsens) concluyeron con un porcentaje de DSR inferior al 4,72% dentro del mismo electrodo (intra-assay), inferior al 31,6% entre diferentes electrodos (inter-assay) e inferior al 5,50% entre diferentes días (inter-assay) con el mismo CH8. Existe una elevada diferencia entre distintos electrodos CH8 de diferentes lotes. -Los estudios de reproducibilidad de ambos inmunosensores indicaron unas desviaciones estándares relativas en la determinación de FB1 del orden de %DSR < 6,7% en el inmunosensor mpELISA espectrofotométrico y %DSR < 10,0% con el inmunosensor electroquímico, en medidas realizadas en un mismo día. Es necesario un calibrado diario realizado simultáneamente junto a las medidas de las muestras. - Los errores relativos de las concentraciones de FB1 en el CRM TR-F100, F-C-433 (Trilogy) obtenidos durante diferentes días con el inmunosensor espectrofotométrico se mantuvieron dentro del intervalo de 2,4-15%, con una DSR del 8%. Las concentraciones de FB1 obtenidas en diferentes días fueron significativamente iguales entre sí e iguales a la concentración certificada en el CRM (95% nivel de confianza). - Los errores relativos de las concentraciones de FB1 obtenidos durante diferentes días con el inmunosensor electroquímico se mantuvieron dentro del intervalo 2,9-14,2% (DSR 10%) para el sustrato electroquímico HQ (Material de referencia MA1140-1 y MA1140-2), y dentro del intervalo 1-15,9% (DSR 9,6%) para el sustrato electroquímico TMB (CRM TR-F100, F-C-433). Se consideraron estadísticamente comparables los resultados obtenidos con ambos mediadores con una probabilidad del 95%. - El inmunosensor mpELISA espectrofotométrico se comparó frente a un kit ELISA comercial (Europroxima, 5121FUM) y se validó frente al método oficial AOAC (HPLC) para la determinación de FB1. Se obtuvo un error relativo del 7,3% (n=4) y del -10,3% (n=2) para el kit comercial ELISA y el HPLC respectivamente. Ambos resultados fueron estadísticamente comparables (probabilidad del 95%) con el obtenido con el inmunosensor espectrofotométrico desarrollado en este trabajo. - El inmunosensor mpELISA espectrofotométrico se validó siguiendo los criterios de la Directiva de Regulación de la Comunidad Europea EC nº 401-2006 sobre el cumplimiento de los métodos de análisis empleados para el control oficial de los niveles de FB1 en alimentos. En el material de referencia certificado TR-F100, F-C-433 se cumplen los criterios de validación establecidos para una concentración de FB1 en la muestra > 500 µg kg-1: %DSRr < 20; %DSRR < 30, y recuperaciones entre 70-110%, por lo que el método desarrollado puede ser considerado oficialmente válido, según los requerimientos establecidos por esta normativa de validación de nuevos métodos para la determinación de FB1 en cereales. - El inmunosensor electroquímico se comparó frente a un kit ELISA comercial (Europroxima, 5121FUM) y se validó frente al método oficial AOAC (HPLC) para la determinación de FB1. Ambos resultados fueron estadísticamente comparables (probabilidad del 95%) con el obtenido con el inmunosensor electroquímico desarrollado en este trabajo. - El inmunosensor electroquímico se validó siguiendo los criterios de la Directiva de Regulación de la Comunidad Europea EC nº 401-2006 sobre el cumplimiento de los métodos de análisis empleados para el control oficial de los niveles de FB1 en alimentos. En todos los casos estudiados (muestras de referencia MA1140A-1 y MA1140A-2, y material de referencia certificado TR-F100, F-C-433), se cumplen los criterios de validación establecidos para una concentración de FB1 en la muestra > 500 µg kg-1: %DSRr < 20; %DSRR < 30, y recuperaciones entre 70-110%, por lo que el método desarrollado puede ser considerado oficial para la determinación de FB1 en cereales al cumplir los requisitos de esta normativa de validación. - Se ha optimizado una extracción conjunta para la FB1 y el DON empleando el método de extracción de la FB1 (MeOH:H2O, 70:30 (m/v), agitando por volteo durante 30 minutos). Los errores obtenidos en la determinación simultánea de FB1 y DON con el CRM de multitoxinas TR-MT100, MTC-9990 (Trilogy) con el inmunosensor espectrofotométrico han sido del 6,4% (n=6) y del -2,2% (n=8) para la FB1 y el DON respectivamente, y para el inmunosensor electroquímico del -2,0% (n=3) para la FB1 y del -2,4 % (n=5) para el DON. El estudio estadístico realizado mostró la no existencia de diferencias significativas (probabilidad del 95%) entre los dos inmunosensores desarrollados. La presencia de ambas matrices no interfiere en los inmunoensayos ni en el procedimiento optimizado para la determinación simultánea de ambas micotoxinas. - El inmunosensor espectrofotométrico desarrollado se ha aplicado para la determinación de FB1 y DON en dos harinas comerciales con matrices de maíz (Haricaman) y trigo (Super). Se obtuvieron 107,3 ± 11,7 µg kg-1 de FB1 y 72,1 ± 11,7 µg kg-1 de DON en la harina de maíz y 39,8 ± 9,5 µg kg-1 de FB1 y 19,1 ± 10,5 µg kg-1 de DON en la harina de trigo. Las concentraciones de ambas micotoxinas en la harina de maíz resultaron mayores cuando se compararon con el HPLC. La determinación de FB1 en la harina de trigo sigue el mismo patrón que las anteriores, sin embargo la concentración de DON en esta harina presenta un valor mayor con la técnica HPLC que con el sensor mpELISA. - El inmunosensor electroquímico desarrollado se ha aplicado para la determinación de FB1 en la harina comercial de maíz con los dos sustratos empleados en el desarrollo de este trabajo. Se obtuvieron 144,3 ± 104,1 µg kg-1 de FB1 con la HQ como sustrato electroquímico y 98,5 ± 57,5 µg kg-1 de FB1 con el TMB como sustrato electroquímico. Una comparativa estadística posterior informó que los resultados obtenidos con el mpELISA y el inmunosensor electroquímico con TMB eran estadísticamente comparables con una probabilidad del 95%, sin embargo no lo eran con el sensor electroquímico que emplea HQ. -Se han estudiado varios modelos para la miniaturización del sensor empleando técnicas de microfluídica. De este modo, todas las etapas del ensayo se realizan de forma automatizada, sin los tiempos de espera propios de la ejecución manual de los inmunosensores descritos. - El dispositivo 2 (copolímero de olefina cíclica, COC) fue el chip escogido donde llevar a cabo todo el proceso de biorreconocimiento del inmunosensor de FB1. Todos los demás diseños que se desarrollaron incluían este chip como parte fundamental de la plataforma microfluídica. Se comprobó, con técnicas ópticas y electroquímicas, que la incubación de las reacciones de competición del sensor dentro del chip se produjo correctamente, siendo el calibrado espectrofotométrico el que presentó un mayor descenso de señal competitiva (73%). -La integración de los electrodos dentro del chip monocanal para la transducción final de la señal electroquímica se presentó en el dispositivo 4, una estructura modular que contiene una plataforma para introducir el chip (dispositivo2) con posibilidad de movimiento y flujo automático gracias a un controlador previamente programado. El porcentaje de descenso de intensidad en la competición con este dispositivo fue del 73%, y se obtuvieron buenos porcentajes de DSR por debajo del 5%. Discusión El uso de biosensores en el análisis de micotoxinas se encuentra en una fase inicial y prometedora, dada la alta sensibilidad de las técnicas voltamétricas en la medida de la corriente, por lo que el número de trabajos con biosensores electroanalíticos y sus aplicaciones en las micotoxinas es muy escaso. Por ello, el presente trabajo de investigación aporta novedad y conocimiento en la determinación de FB1 mediante biosensores analíticos. Se ha desarrollado y validado un inmunoensayo espectrofotométrico y otro electroquímico muy sensible para la determinación rápida de la micotoxina FB1 en muestras de maíz. Este inmunoensayo permite el análisis simultáneo de ocho muestras, que disminuye considerablemente los tiempos de medición y mejora la reproducibilidad con respecto a transductores individuales. El método optimizado ofrece las ventajas de tener pretratamientos de la muestra muy simples, rapidez y rentabilidad. Este inmunoensayo detecta los niveles permitidos de FB1 por debajo de la legislación de la Unión Europea (200-4000 kg µg-1 FB1), tiene buena reproducibilidad (%DSR entre el 5-14%) y escasa afinidad hacia otras micotoxinas que podría tener estar presentes de forma simultánea y natural en muestras de cereales. Además, durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral se han publicado los siguientes trabajos en revistas científicas: - Vidal J.C., Bonel L., Ezquerra A., Duato P., Castillo J.R.; An electrochemical immunosensor for ochratoxin A determination in wines based on a monoclonal antibody and paramagnetic microbeads. Analytical and Bioanalytical Chemistry 403 (2012) 1585-1593. - Vidal J.C., Bonel L., Ezquerra A., Hernandez S., Bertolin J.R., Cubel C., Castillo J.R.; Electrochemical affinity biosensors for detection of mycotoxins: A review. Biosensors & Bioelectronics 49 (2013) 146-158. - Ezquerra A., Vidal J.C., Bonel L., Castillo J.R.; A validated multi-channel electrochemical immunoassay for rapid fumonisin B1 determinations in cereal samples. Analytical Methods (Aceptado,marzo 2015). DOI: 10.1039/c4ay02897j El biosensor electroquímico desarrollado en esta Tesis Doctoral ha dado lugar a una patente denominada: INMUNOSENSOR ELECTROQUÍMICO PARA LA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA MICOTOXINA FB1 (solicitud P201330976), que se encuentra registrada (referencia ES1510.105a) en la Oficina Española de Patentes y Marcas (OEPM) con fecha 28 de Junio de 2013.