Fundamentos moleculares del ensamblaje y las propiedades mecánicas de partículas víricas con aplicaciones biotecnológicas y nanotecnológicas

Résumé

En este estudio hemos realizado un análisis detallado de los intermediarios y ruta de autoensamblaje reversible de la cápsida de un virus icosaédrico estructuralmente muy sencillo, y un análisis sistemático de los determinantes moleculares de sus propiedades mecánicas, y de la relación de estas propiedades entre sí. Para ello hemos utilizado diferentes técnicas, incluyendo una combinación de microscopía electrónica (EM) y microscopía de fuerzas atómicas (AFM) para el análisis individual de partículas víricas, e ingeniería de proteínas para obtener cápsidas mutantes con las que analizar el papel de diferentes residuos aminoacídicos en las propiedades mecánicas de la cápsida. Nuestro modelo de trabajo ha sido el virus minuto del ratón (MVM). En la primera parte de este estudio hemos realizado un sistema para el ensamblaje reversible in vitro de la cápsida de MVM a partir de elementos básicos de construcción estables (trímeros de subunidades de la cápsida), determinando las condiciones necesarias para que se produzca dicho ensamblaje y modificando algunas condiciones como el pH para conseguir una eficacia del proceso superior al 50%. El ensamblaje de esta cápsida sigue una cinética sigmoidal dependiente de concentración de proteína, indicativa de un fenómeno de nucleación y crecimiento. En la segunda parte de este estudio hemos analizado en detalle las rutas de ensamblaje y desensamblaje de MVM, comparándolas entre sí. Hemos conseguido que una serie de intermediarios, sean lo suficientemente estables para ser visualizados por EM y AFM, lo que nos ha permitido caracterizar su morfología y topografía, y analizar la cinética de su aparición y/o desaparicion para trazar la ruta del proceso. Los resultados obtenidos nos permiten proponer un modelo empírico de ensamblaje reversible de una cápsida icosaédrica sencilla basado en la adición secuencial de elementos de construcción que verifica predicciones detalladas obtenidas mediante simulaciones de Dinámica Molecular de grano grueso. La eficacia y exactitud del proceso de autoensamblaje queda reflejada en la elevada proporción de cápsidas reensambladas en condiciones adecuadas, y en la infrecuente aparición de partículas víricas aberrantes durante la reacción. En la tercera parte de este estudio se ha continuado el estudio que venimos realizando en el grupo sobre biomecánica de virus utilizando MVM y otros virus como modelos. Hemos integrado resultados parciales previos sobre el papel de diferentes residuos aminoacídicos en las interfases entre subunidades de la cápsida sobre la rigidez de ésta, con nuevos resultados obtenidos en este estudio sobre el papel de estos residuos tanto en la rigidez como en otras propiedades mecánicas, relacionadas con la resistencia de la cápsida a la rotura. Para ello se compararon para cápsidas salvaje (wt) y mutantes individuales, indentadas en diferentes regiones, los valores obtenidos para la constante elástica (como medida de rigidez relativa), la máxima deformación admitida (como medida de fragilidad relativa), la fuerza necesaria (como medida de resistencia relativa a la rotura), el trabajo realizado para la rotura, y las rutas y estados finales alternativos observados para el proceso de rotura. Los resultados revelaron que la cápsida natural (wt) de MVM presenta una rigidez y resistencia a fuerzas de rotura mayores, y una fragilidad menor que la mayoría de otras cápsidas víricas cuasiesféricas analizadas. De modo destacable, la cápsida natural de MVM parece encontrarse cerca de un mínimo local de rigidez y fragilidad, y de un máximo de resistencia a la rotura, al menos cuando se compara con casi cualquier mutante analizado. A este particular estado mecánico de la cápsida natural contribuyen en diferente medida muchos residuos aminoacídicos situados en las interfases entre los elementos de construcción triméricos: el truncamiento de sus cadenas laterales y la eliminación de las interacciones de éstas con otros residuos causa, en la mayoría de los casos, un aumento en la rigidez y fragilidad y una disminución en la resistencia a fuerzas de rotura. Además, se observó una buena correlación cuantitativa entre las variaciones de algunos parámetros mecánicos en respuesta a mutaciones, especialmente entre el aumento de rigidez, aumento de fragilidad, y disminución del trabajo necesario para la rotura. Estas variaciones en las propiedades mecánicas de la cápsida, y en especial el aumento de rigidez de regiones centradas en las interfases entre trímeros o en los propios trímeros, se encuentran asociadas con una moderada disminución en la eficacia de ensamblaje de la cápsida en la célula y (consiguientemente), también de la infectividad del virus (título de progenie producida). Observamos además que el papel de diferentes residuos interfásicos sobre las propiedades mecánicas es diferente. Residuos enterrados a lo largo de la línea principal de cada interfase entre trímeros contribuyen en mayor medida a mantener la flexibilidad mecánica en las interfases y los propios trímeros, mientras que algunos residuos situados en bucles expuestos en las interfases ejercen un mayor papel en la resistencia de la cápsida frente a su rotura mecánica. El conjunto de conocimientos básicos obtenidos sobre la ruta de autoensamblaje y los determinantes moleculares de las propiedades mecánicas de una cápsida vírica icosaédrica estructuralmente sencilla puede ser de utilidad para el desarrollo de nuevos antivirales y de nanopartículas basadas en virus para diferentes aplicaciones nanobiotecnológicas.