Dimerización de ERK como determinante de factores de progresión tumoral

Resumen

Resumen: Un conjunto de datos vincula la ruta de señalización de ERK a la tumorogénesis y progresión tumoral. En general, aproximadamente el 30 % de los tumores malignos humanos albergan mutaciones activadoras en los componentes de la vía RAS-ERK; particularmente en miembros de la familia RAS (22 %) y BRAF (7 %) y, en menor medida, en las quinasas de doble especificidad, MEK (Yaeger & Corcoran, 2019), que dan como resultado una señalización aberrante de ERK. Así, la inhibición de la señalización a través de dicha ruta resulta una estrategia válida como terapia antineoplásica en estos tumores. La búsqueda de nuevas dianas moleculares sobre las que dirigir dichas terapias es imperativa, una vez que los abordajes clásicos, centrados en la inhibición de la actividad catalítica de las distintas quinasas no han dado los resultados esperados (García-Gómez et al., 2018). La señalización de la vía RAS-ERK se activa por diferentes factores externos (factores de crecimiento, citoquinas, hormonas) que regulan la amplitud, intensidad y duración de la señal de forma distinta, promoviendo diferentes respuestas biológicas (Lambert et al., 2012; Pearson et al., 2001). Publicaciones previas revelan que distintos factores externos pueden regular procesos biológicos de manera distinta a través de la activación de ERK (Ma et al., 2012). Resultados previos de nuestro laboratorio han demostrado que la dimerización de ERK juega un papel importante en tumorogénesis y metástasis (Herrero et al., 2015). En células estimuladas con factor de crecimiento epidérmico EGF, ERK fosforilada en forma de dímeros, libres o unidos a proteínas de andamiaje o scaffold, se localiza en el citoplasma, mientras que ERK fosforilado en forma de monómero fundamentalmente se transloca al núcleo (Casar et al., 2008). Esto sugiere que la dimerización de ERK podría ser crucial en la regulación de las diferentes respuestas celulares mediadas por la activación de la ruta RAS-ERK. Además, otros estudios publicados por nuestro laboratorio demuestran que las proteínas scaffold intervienen modulando la intensidad, la amplitud y la localización de la señal de ERK mediante la formación de complejos con los distintos componentes de la ruta ERK (RAF-MEK-ERK) (Casar et al., 2009). Además, hemos demostrado que las proteínas scaffold sirven como plataformas de dimerización de ERK en el citoplasma (Casar et al., 2008). Por ello, estas proteínas se han considerado susceptibles de ser utilizadas como dianas terapéuticas en cáncer. Por otro lado, estudios previos describen que la señalización de ERK también está regulada por factores dinámicos del citoesqueleto que controlan la regulación de la morfología, adhesión y migración celular, procesos íntimamente involucrados en la metástasis celular (Deakin et al., 2012; Fife et al., 2014). Por tanto, la relación del citoesqueleto con la regulación de la señalización mediada por ERK, es un factor para tener en cuenta como posible determinante de los acontecimientos biológicos inducidos por la activación ERK. Hipótesis y objetivos: Basándonos en estos datos previos nuestra hipótesis principal es: La dimerización de ERK es determinante en la regulación de procesos biológicos específicos, asociados a progresión tumoral, desencadenados en respuesta a diferentes estímulos. Nuestro objetivo principal es estudiar el papel de la dimerización de ERK en respuesta a diferentes estímulos involucrados en la tumorogénesis y la progresión tumoral. Se han propuesto los siguientes objetivos para desarrollar en este estudio: Objetivo 1.- Análisis de la dimerización de ERK en respuesta a diferentes estímulos. 1.1. Estudiar la dimerización de ERK en respuesta a estimulación diferencial en líneas tumorales. 1.2. Determinar el interactoma de ERK en líneas celulares estimuladas con diferentes agonistas. 1.3. Estudiar la función de KSR en migración. Objetivo 2.- Estudiar la función de los dímeros de ERK en la morfología celular a través de la remodelación del citoesqueleto de actina. Objetivo 3.- Determinar el papel de los dímeros de ERK en migración. 3.1. Estudiar el efecto de DEL-22379 sobre la morfología celular. 3.2. Estudiar el papel de los dímeros de ERK en migración en un modelo 2D. Objetivo 4.- Determinar la relación de la dimerización de ERK en la progresión tumoral un modelo de invasión 3D y el modelo animal de embrión de pollo. Materiales y métodos Para determinar el papel de la dimerización de ERK en quimiotaxis e invasión celular, se ha empleado el ensayo transwell. Para ello, Se determinó migración e invasión celular tras el tratamiento del inhibidor de dimerización de ERK, DEL-22379, y el inhibidor de la actividad catalítica de MEK, U0126. También se ha analizado la capacidad quimiotáctica usando los mutantes de ERK2: ERK2-H176E mutante incapaz de dimerizar, que actúa como dominante inhibitoria impidiendo la dimerización de ERK endógeno (Khokhlatchev et al., 1998); y ERK2 R65S, ERK2 constitutivamente activo (Levin-Salomon et al., 2008) y en forma dimérica. Para determinar los interactores de ERK específicos en función de su estado monomérico/dimérico, realizamos espectrometría de masas utilizando los factores de crecimiento EGF e IGF-1. Distintos estímulos externos median distintas respuestas celulares que requieren cambios en la morfología celular (Pandya et al., 2017; Saw et al., 2014). Por ello, se ha prestado interés en observar mediante inmunofluorescencia la morfología celular y su relación con la expresión de KSR1, como potenciador de la dimerización de ERK. Se ha evaluado la morfología celular y el comportamiento de distintas líneas celulares mediante video microscopía durante 48 h, teniendo en cuenta la distancia migratoria, la velocidad y la direccionalidad. Para determinar la relación entre el citoesqueleto de actina y la dimerización de ERK en un modelo de invasión 3D (formación de organoides). Se ha investigado el papel de los dímeros de ERK en la formación de esferoides de mama, MDA-MB-231, utilizando los inhibidores de ERK, DEL-22379 y U0126. Además, se ha investigado la relación entre el estado de ERK y el citoesqueleto de actina durante la invasión celular colectiva. Para determinar el papel de la dimerización de ERK en el proceso de intravasación y metástasis se ha utilizado el modelo de metástasis espontánea de embrión de pollo. Se ha utilizado el modelo celular MDA-MB-231 bajo el tratamiento de inhibidores de ERK, DEL-22379 y U0126. Resultados y discusión 1. La dimerización de ERK es estímulo dependiente. En este trabajo se ha utilizado como modelo celular la línea celular de cáncer de mama MCF-7 que responde a los estímulos externos EGF e IGF-1. Nuestros resultados indican que mientras que ambos estímulos inducen la fosforilación /activación de ERK, sólo EGF induce dimerización, no siendo el caso en células estimuladas con IGF-1. 2. La dimerización de ERK promueve distintas respuestas celulares. Hemos determinado que EGF incrementa la respuesta quimiotáctica de las células. Por el contrario, IGF1 estimula la degradación de la matriz celular. De lo que podría deducirse que son los dímeros de ERK quienes median en la respuesta quimiotáctica, mientras que serán los monómeros de ERK quienes induzcan la degradación de la matriz. Además, la expresión de ERK H176E, que evita la dimerización de ERK incrementando la concentración de monómeros en el núcleo, evita la quimiotaxis. Mientras que la expresión de ERK R65S, constitutivamente dimerizado en el citoplasma, potencia dicha quimiotaxis. 3. Identificación de KSR1 como interactor específico de ERK2. La espectrometría de masas se llevó a cabo con el propósito de identificar interactores de ERK2 y relacionar estas proteínas con una mayor dimerización de ERK cuando se estimula con EGF. Se obtiene de este ensayo que KSR1 es una proteína específica del estímulo EGF, que como ya se había descrito previamente, facilita la dimerización de ERK en el citoplasma (Casar et al., 2008) y está involucrada en respuestas celulares en respuesta a un estímulo externo, según el análisis de enriquecimiento de genes. 4. KSR1 regula la habilidad quimiotáctica de las células a través de la dimerización de ERK. Los resultados revelan que la sobreexpresión de KSR1 promueve la quimiotaxis celular Se interpreta que altos niveles de KSR1 incrementan la proporción de ERK en estado dimérico. 5. Efecto de la dimerización de ERK, mediado por KSR1 y el citoesqueleto de actina, en la morfología celular. Se han observado cambios en la morfología celular similares mediados por a la falta de expresión de KSR1 y la disrupción del citoesqueleto de la actina inducido por la citocalasina D. La inhibición de la polimerización de actina promueve la localización perinuclear de la actina, efecto visto cuando se disminuye la expresión de KSR (siKSR). La morfología redondeada-ameboide adquirida por las células bajo estas condiciones se relaciona con modos de invasión celular (Pandya et al., 2017). 6. La dimerización de ERK regula crecimiento tumoral y metástasis de células de cáncer de mama en el modelo de embrión de pollo En el modelo de metástasis espontánea de embrión de pollo hemos observado que la línea celular MDA-MB-231, en la que ERK se mantiene en estado dimérico, los inhibidores de ERK, DEL-22379 y U0126 disminuyen la intravasación y la colonización de órganos secundarios como el hígado y el cerebro. Estos datos sugieren que los dímeros de ERK promueven crecimiento tumoral y metástasis como anteriormente se ha publicado en líneas celulares de melanoma (Herrero et al., 2015). Conclusiones: 1. La dimerización de ERK está regulada de forma distinta por diferentes agonistas. La estimulación con EGF desencadena la dimerización de ERK, pero no IGF-1. 2. La dimerización de ERK promueve distintas respuestas celulares. Los dímeros ERK inducen la migración de células de cáncer de mama. 3. KSR1 es un interactor específico de ERK en respuesta a EGF en células de cáncer de mama. 4. La sobreexpresión de KSR1 promueve la migración de células de cáncer de mama regulando la dimerización de ERK. 5. Los dímeros ERK regulan la remodelación del citoesqueleto de actina para promover la invasión celular colectiva en organoides 3D. 6. Los dímeros de ERK promueven el crecimiento tumoral en organoides 3D y la metástasis espontánea de células de cáncer de mama utilizando un modelo de xenoinjerto animal. Referencias: Casar, B., Pinto, A., & Crespo, P. (2008). Essential Role of ERK Dimers in the Activation of Cytoplasmic but Not Nuclear Substrates by ERK-Scaffold Complexes. Molecular Cell. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2008.07.024 Casar, B., Pinto, A., & Crespo, P. (2009). ERK dimers and scaffold proteins: Unexpected partners for a forgotten (cytoplasmic) task. In Cell Cycle. https://doi.org/10.4161/cc.8.7.8078 Deakin, N. O., Pignatelli, J., & Turner, C. E. (2012). Diverse Roles for the Paxillin Family of Proteins in Cancer. 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