Identificación y cuantificación de Clostridium tyrobutyricum por PCR a tiempo real en muestras de leche

Resumen

La identificación y cuantificación de microorganismos por técnicas de biología molecular, particularmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real, está siendo ampliamente empleada hoy día. Sin embargo, no existe un método de PCR a tiempo a real que permita la enumeración del microorganismo alterante Clostridium tyrobutyricum. Esta bacteria es la principal responsable de la hinchazón tardía en quesos curados y semicurados. En este trabajo hemos optimizado un protocolo para la extracción de ADN microbiano a partir de leche, y hemos desarrollado un método de PCR a tiempo real que permite la detección cuantitativa de C. tyrobutyricum. El sistema de PCR amplifica una región del gen flagellin (fla) e incluye un control interno de amplificación (IAC). La coamplificación del IAC en formato de PCR duplex permite descartar falsos negativos que se producen con frecuencia debido al efecto inhibitorio que producen ciertos compuestos de la leche. El ensayo mostró ser 100% específico, como se pudo comprobar utilizando 19 aislados de Clostridium y 40 especies que no eran del género. Asimismo, la cuantificación del número de esporas por el método nuevo de PCR a tiempo real se comparó con el recuento de esporas por la técnica del número más probable (NMP) en muestras de leche.