Interacción de nanoestructuras de carbono o metálicas con (bio)moléculas y su aplicación al desarrollo de sensores

Resumen

El objetivo principal de este trabajo de tesis es el uso de nanomateriales para la modificación de electrodos con la finalidad de desarrollar sensores y biosensores electroquímicos sensibles y robustos. Para ello se han utilizado diferentes nanomateriales, que pueden estar funcionalizados o no, y son: nanotubos de carbono, grafeno, nanopartículas de oro y nanopuntos de carbono. Se estudiaron diferentes estrategias de modificación de la superficie de electrodos serigrafiados de oro y de carbono con nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNTs). La estrategia 1 consistió en la diazotación y electroinjerto de MWCNTs aminados sobre electrodos de oro y carbono. Para las estrategias 2, 3 y 4 se modificó la superficie de oro con 4-aminotiofenol, de manera que queden grupos amino expuestos hacia la disolución. Estos grupos amino se sometieron al proceso de diazotación en las estrategias 2 y 3 y, a continuación, se electroinjertaron sobre MWCNTs no modificados (estrategia 2) o se hicieron reaccionar con MWCNTs aminados formando un enlace triazeno (estrategia 3). La estrategia 4 se basó en la formación de un enlace amida con MWCNTs carboxilados. Por último, a modo de comparación, se estudió como estrategia 5 la adsorción directa de los MWCNTs sobre la superficie de los electrodos serigrafiados de oro y carbono. Las superficies se caracterizaron mediante SEM, AFM y voltamperometría cíclica. Posteriormente, con el objeto de mejorar sus propiedades electrocatalíticas, los electrodos nanoestructurados se modificaron con N,N-bis(3,4-dihidroxibenciliden)-1,2-diaminobenceno (3,4-DHS) por adsorción directa. Se estudió la actividad electrocatalítica frente a la oxidación de NADH e hidrazina, concluyéndose que los mejores resultados se obtienen con las plataformas desarrolladas siguiendo la estrategia 1 en presencia de 3,4-DHS. Por tanto, estas plataformas se utilizaron para desarrollar dos sensores, uno de NADH, para lo que se emplearon electrodos serigrafiados de oro y otro de hidrazina, para lo que se utilizaron electrodos serigrafiados de carbono. Se obtuvieron buenos resultados para ambos analitos, con unos límites de detección de 3.4 y 6.0 µM, respectivamente. El 3,4-DHS también se empleó con una doble función, reductor y funcionalizador, en la reducción de óxido de grafeno (GO) para producir directamente grafeno modificado químicamente (rGO-DHS) mediante un tratamiento térmico. El material resultante se caracterizó mediante diferentes técnicas, confirmando, por un lado, la reducción del GO y, por otro, la presencia del 3,4-DHS en su superficie. Se modificaron electrodos serigrafiados de carbono con rGO-DHS y se caracterizaron mediante técnicas electroquímicas, observándose un comportamiento diferente al comparar con electrodos modificados con GO. Concretamente, los electrodos modificados con rGO-DHS presentan una menor resistencia a la transferencia de carga. Además, los electrodos modificados con rGO-DHS presentan propiedades electrocatalíticas frente a la oxidación de hidrazina, lo que se utilizó como base para el desarrollo de un sensor para la determinación de este analito. Se obtuvieron buenas propiedades analíticas, con un límite de detección de 0.20 µM. También se han empleado estos electrodos para la construcción de un biosensor amperométrico de lactato tras modificar la superficie nanoestructurada con la enzima lactato oxidasa (LOx). El 3,4-DHS que se encuentra adsorbido sobre la superficie del grafeno contiene grupos quinona y puede actuar como un mediador redox, aceptando los electrones involucrados en la oxidación enzimática de lactato. De esta manera, es posible reducir el sobrepotencial y evitar los problemas derivados de la presencia de sustancias potencialmente interferentes. De hecho, el estudio de la influencia de estas sustancias sobre la respuesta del biosensor reveló que su presencia no afecta significativamente, incluso cuando se encuentran en concentración igual al analito, excepto en el caso del ácido ascórbico. El biosensor desarrollado se empleó en la determinación directa de lactato en muestras reales de vino blanco, sin necesidad de procesos de separación previa, únicamente fue necesario realizar una dilución de la muestra. De manera similar al caso de GO, se utilizó el 3,4-DHS como reductor en la síntesis de nanopartículas de oro funcionalizadas (AuNPs-DHS) a partir de una sal. En este caso, la reacción transcurrió a temperatura ambiente. La molécula de 3,4-DHS actúa, además de como reductor, como estabilizante, permitiendo la formación de una suspensión coloidal estable mediante una reacción de un único paso. Se optimizaron los parámetros de síntesis, tales como concentración, pH o temperatura y las nanopartículas sintetizadas se caracterizaron mediante diferentes técnicas. Esto permitió confirmar que las nanopartículas tienen un tamaño medio de 33 ± 3 nm y que se encuentran rodeadas por moléculas de 3,4-DHS unidas al oro a través de los grupos fenolato y que alrededor de ellas se forma una capa de moléculas de 3,4-DHS en su forma oxidada. Cuando las nanoestructuras AuNPs-DHS se depositan sobre electrodos serigrafiados de carbono presentan actividad electrocatalítica frente a la oxidación de hidrazina y la oxidación y reducción de peróxido de hidrógeno. Los sensores desarrollados para ambos analitos presentan unas propiedades analíticas excelentes, obteniéndose unos límites de detección de 22 nM, 0.15 µM y 0.32 µM para la oxidación de hidrazina y oxidación y reducción de peróxido, respectivamente, además de unos intervalos lineales muy amplios y una buena reproducibilidad. Además, se construyó un biosensor de lactato modificando los electrodos nanoestructurados con AuNPs-DHS con la enzima LOx. A diferencia del biosensor desarrollado con rGO-DHS, en este caso, la determinación de lactato se realiza a través de la cuantificación del peróxido generado enzimáticamente, cuya oxidación está catalizada por las AuNPs-DHS. El biosensor desarrollado presenta un límite de detección de 2.6 µM, una buena reproducibilidad y una elevada selectividad. Este biosensor se aplicó en la determinación de lactato directamente en muestras reales de vino blanco, cerveza y yogur, con una dilución como único tratamiento de muestra. Se obtuvieron recuperaciones cercanas al 100% al comparar los resultados con los obtenidos con un kit enzimático comercial. Por otro lado se sintetizaron nanopuntos de carbono (CDs) mediante la carbonización térmica de dos moléculas orgánicas sencillas, EGTA y Tris. La caracterización mediante diferentes técnicas permitió determinar que los CDs sintetizados tienen un tamaño medio de 3.4 ± 0.5 nm y que presentan grupos amida y alcohol. Se estudió la interacción de los CDs con ADN, observándose que la presencia de este provoca una amortiguación de la fluorescencia de los CDs. Se modificaron electrodos serigrafiados de oro con los CDs y se caracterizaron. Estos electrodos nanoestructurados se modificaron con una sonda de ADN no modificada de 25 bases correspondiente a la bacteria Helicobacter pylori. Tras su incubación con una secuencia complementaria o no complementaria se acumuló el indicador electroquímico, safranina, mediante la aplicación de barridos sucesivos de potencial. La señal obtenida para el electrodo modificado con la sonda e incubado con la secuencia complementaria fue mucho mayor que la obtenida para la secuencia no complementaria, demostrando que los electrodos nanoestructurados sirven como plataforma para la inmovilización de sondas de ADN no modificadas que mantienen su capacidad de reconocimiento. Además, cuando la sonda se hibrida con una secuencia que contiene una sola base no complementaria, la señal es menor que para la complementaria y mayor que para la no complementaria, por lo que se puede afirmar que el biosensor desarrollado es capaz de detectar mutaciones puntuales en una secuencia de 25 bases. El biosensor de ADN desarrollado se aplicó a la detección de mutaciones asociadas a la fibrosis quística en ADN real de PCR extraído de células sanguíneas. Para ello, se modificó el electrodo nanoestructurado con una sonda de ADN de 100 bases complementaria a un fragmento de 373 bases del exón 11 del gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). Esta sonda se incubó con una secuencia complementaria, correspondiente a pacientes sanos, y con una secuencia que contiene una mutación consistente en la deleción de tres nucleótidos, que es la causante de la enfermedad en la mayoría de los casos. La señal obtenida tras la acumulación de la safranina fue aproximadamente el doble para la secuencia complementaria que para la mutada, confirmando que el biosensor desarrollado es capaz de diferenciar entre secuencias que porten o no la mutación. Es decir, permite diferenciar entre pacientes sanos y enfermos, por lo que puede ser utilizado como método de cribado en la detección de enfermedades asociadas a mutaciones genéticas.