Efecto de los tratamientos tecnológicos sobre las propiedades físico-químicas y biológicas de la lisozima y la lactoferrina humanas recombinantes de arroz

Resumen

EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS TECNOLÓGICOS SOBRE LAS PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS Y BIOLÓGICAS DE LA LISOZIMA Y LA LACTOFERRINA HUMANAS RECOMBINANTES DE ARROZ INTRODUCCIÓN La lisozima de huevo y la lactoferrina bovina son proteínas que cuentan con numerosas aplicaciones a nivel industrial, tanto en la industria alimentaria como en la farmacéutica [1,2]. El empleo de las proteínas humanas recombinantes sería muy interesante para algunas aplicaciones concretas, como la suplementación de leches infantiles [3], como ingredientes en alimentos funcionales o en formulaciones farmacéuticas; puesto que estas proteínas son, en principio, estructuralmente iguales a las humanas [4,5], con las ventajas que ello conllevaría. Además, el empleo de arroz modificado genéticamente permite la obtención de proteínas a escala industrial, incluso empleando directamente la harina, ya que el arroz es uno de los alimentos menos alergénicos que existe. No obstante, es necesario conocer cómo se ven afectadas las propiedades físico-químicas y biológicas de estas proteínas al verse sometidas a los tratamientos tecnológicos que se emplean habitualmente en la industria alimentaria o farmacéutica. OBJETIVOS El objetivo de este trabajo ha sido estudiar la estabilidad térmica de la lisozima humana recombinante de arroz (rhLz) y compararla con la de la lisozima humana. También hemos evaluado la termorresistencia de la lactoferrina humana recombinante de arroz (rhLF) con tres saturaciones de hierro diferentes. Además, hemos estudiado el efecto de diversos tratamientos térmicos y de altas presiones sobre la estructura, la actividad enzimática y la actividad antibacteriana de la rhLz frente a Escherichia coli O157:H7 y frente a Listeria monocytogenes 4b. También hemos ensayado diversos modos de aumentar esta actividad antibacteriana combinando la rhLz con rhLF y con EDTA. Hemos comparado además la actividad antibacteriana de la rhLz con la de la lisozima de huevo. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El estudio de la termorresistencia de la rhLz realizado mediante calorimetría de barrido diferencial ha revelado que es más termoestable a pH ácido, y es más termoestable a pH neutro que a pH básico. La estabilidad térmica de la rhLz es muy similar a la de la lisozima de leche humana a pH ácido y neutro; sin embargo, a pH básico la rhLz es más estable que la de la leche humana. Los tratamientos térmicos intensos de la rhLz provocan un aumento de la hidrofobicidad y causan la ruptura de puentes disulfuro. También se observa la formación de agregados proteicos, probablemente debido a la formación de puentes disulfuro intermoleculares y al aumento de la hidrofobicidad de la proteína. A pesar de estos cambios estructurales, la inmunorreactividad de la proteína apenas cambia, independientemente del tratamiento térmico aplicado. El proceso de desnaturalización térmica de la rhLF, se ve favorecido al aumentar la temperatura y el tiempo de tratamiento; y se produce de forma más rápida para la forma desaturada (forma apo) que para la forma saturada con hierro (forma holo). La forma asis, que es la forma en la que se extrae del arroz y presenta una saturación de hierro de aproximadamente el 60%, no se desnaturaliza siguiendo este modelo, puesto que su termorresistencia no disminuye de forma progresiva al aumentar la temperatura y el tiempo de tratamiento en el rango entre 79ºC y 84ºC. Los resultados obtenidos permiten predecir el comportamiento de la lactoferrina humana recombinante frente a los distintos tratamientos térmicos. La termoestabilidad de la rhLz disminuye ligeramente en presencia de la rhLF en sus tres formas apo, asis y holo; mientras que la termorresistencia de esta proteína en cualquiera de estas tres formas apenas se ve modificada en presencia de la rhLz. La actividad antibacteriana de la rhLz es mayor frente a Listeria monocytogenes 4b que frente a Escherichia coli O157:H7; no obstante, este efecto antibacteriano es pequeño. La adición de EDTA hace disminuir la actividad antibacteriana de la rhLz frente a L. monocytogenes y apenas la mejora frente a E. coli. La adición de rhLF en sus formas apo o asis no mejora la acción antibacteriana de la rhLz frente a L. monocytogenes, aunque sí ligeramente frente a E. coli. Se observa que el grado de saturación de hierro de la rhLF no influye en los resultados. Por otra parte, la adición de EDTA hace que aumente la actividad antibacteriana de la rhLF apo frente a ambas bacterias. En este caso, la acción antibacteriana se debe a la acción conjunta de esta proteína y el quelante, y no se ve modificada por la adición de rhLz. La lisozima humana recombinante de arroz sometida a los tratamientos térmicos de 63ºC durante 30 min y a 72ºC, 85ºC y 92ºC durante 15 s, así como a 72ºC durante 10 min tiene una actividad antibacteriana mucho mayor que la proteína sin tratar, tanto frente a Listeria monocytogenes 4B como frente a Escherichia coli O157:H7, siendo este efecto menor frente a esta última. Sin embargo, los tratamientos a 85ºC y 92ºC durante 10 min hacen disminuir esta actividad frente a ambas bacterias. La actividad antibacteriana de la rhLz combinada con la rhLF en sus formas apo o asis aumenta tras ser sometidas a tratamientos térmicos de 63ºC durante 30 min y a 72ºC, 85ºC y 92ºC durante 15 s, así como a 72ºC durante 10 min, tanto frente a L. monocytogenes como a E. coli. Los tratamientos a 85ºC y 92ºC durante 10 min hacen disminuir la actividad antibacteriana de la mezcla de ambas proteínas. La actividad antibacteriana de la lisozima de huevo frente a Listeria monocytogenes 4b y a Escherichia coli O157:H7, es menor que la de la rhLz; pero aumenta al ser sometida a tratamientos térmicos a 63ºC durante 30 min y a 72ºC, 85ºC y 92ºC durante 15 s, así como a 72ºC durante 10 min. Este efecto antibacteriano es mayor sobre L. monocytogenes que sobre E. coli; no obstante, es menor que en el caso de la rhLz sometida a los mismos tratamientos térmicos. La actividad antibacteriana de la lisozima de huevo en combinación con la rhLF en sus formas apo o asis es más efectiva que la rhLz combinada también con esta proteína frente a L. monocytogenes y a E. coli. Los mejores resultados se obtuvieron combinando la lisozima de huevo con la rhLF apo. la actividad antibacteriana de la lisozima de huevo combinada con la rhLF en sus formas apo o asis aumenta tras ser sometidas a tratamientos térmicos poco intensos. El tratamiento de altas presiones de la rhLz en leche, lactosuero y PBS a 500 y a 600 MPa a 20ºC durante 15 min no modifica ni su actividad enzimática ni su actividad antibacteriana frente a L. monocytogenes. Asimismo, el tratamiento a 500 MPa de la rhLz en los mismos medios no modifica su actividad antibacteriana frente a Escherichia coli O157:H7; mientras que a 600 MPa aumenta dicha actividad en los tres medios, siendo este efecto potenciador menor en el lactosuero. La rhLz conserva como mínimo el 75% de su actividad enzimática tras los tratamientos térmicos a 63ºC durante 30 min y a 72ºC, 85ºC y 92ºC durante 15 s, así como a 72ºC durante 10 min. Por tanto, el empleo de la rhLz y de la rhLF como ingredientes en alimentos sometidos a tratamientos de pasteurización de diferente intensidad no implicaría la pérdida de su acción antibacteriana, ya que de hecho se vería aumentada. Sin embargo, el comportamiento de estas proteínas en matrices más complejas debe ser estudiado, puesto que en nuestro trabajo los tratamientos térmicos se aplicaron en un medio simple, como es el tampón fosfato, y se desconoce cuáles serían las posibles interacciones de estas proteínas debidas al calor con otros componentes en un alimento o en una formulación farmacéutica. Por otra parte, la aplicación del tratamiento por altas presiones se estudió en medios más complejos, como son la leche y el lactosuero, y observamos que la actividad enzimática se mantenía en ambos, y que la actividad antibacteriana frente a Escherichia coli O157:H7 aumentó en comparación con la de las muestras no tratadas. Estos resultados no eximen de realizar investigaciones con otros alimentos, pero resultan esperanzadores, puesto que el empleo combinado de los tratamientos térmicos suaves o de altas presiones con la rhLz; así como el de los tratamientos térmicos suaves con la rhLz y la rhLF, podría resultar en una mejora de la seguridad alimentaria al reducir el número de bacterias patógenas en los alimentos 1 Proctor V. A., Cunningham F. E. (1988) The chemistry of lysozyme and its use as a food preservative and a pharmaceutical. Crit. Rev. Food Sci. 26, 359 -395 2 Tomita M., Wakabayashi H., Yamauchi K., Teraguchi S., Hayasawa H. (2002) Bovine lactoferrin and lactoferricin derived from milk: production and applications. Biochem. Cell Biol. 80, 109-112 3 Lönnerdal B. (1985) Biochemistry and physiological function of human milk proteins. Am. J. Clin. Nutr. 42, 1299-1317 4 Huang J., Nandi S., Wu L., Yalda D., Bartley G., Rodriguez R., Lonnerdal B., Huang N. (2002) Expression of natural antimicrobial human lysozyme in rice grains. Mol. Breeding 10, 83 - 94 5 Suzuki Y. A., Kelleher S. L., Yalda D., Wu L., Huang J., Huang N., Lönnerdal B. (2003) Expression, characterization, and biologic activity of recombinant human lactoferrin in rice. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 36, 190-199.