Marcadores de estrés oxidativo y envejecimiento. El ejercicio físico controlado sobre los niveles de parámetros oxidativos en mujeres mayores. Estudio especial del estado redox y la modificación oxidativa del adn

Resumen

INTRODUCCIÓN Existe una tendencia al envejecimiento constatada en todos los países desarrollados como consecuencia del aumento de la esperanza de vida y la disminución de la tasa de fecundidad. Desde la "Teoría del Envejecimiento Exitoso" de Rowe y Kahn como mecanismo de prevenir la enfermedad y la discapacidad, muchos autores han sugerido la importancia de investigar este proceso y así, poder modificar las alteraciones fisiológicas asociadas mediante intervenciones fisiológicas o sociales, habiéndose convertido su estudio en una disciplina de estudio de gran interés para la comunidad científica. La reiteración progresiva sufrida por las moléculas del organismo y su disfunción biológica son un punto de debate, si bien la teoría más aceptada es la del estrés oxidativo (EO). Prácticamente todas las teorías que tratan de explicar el envejecimiento intentan responder dos cuestiones fundamentales: 1) Averiguar las causas del proceso desde el punto de vista de la biología molecular y evolutiva. 2) Averiguar qué mecanismos determinan la esperanza de vida. Además, las mitocondrias ejercen un papel en el envejecimiento mediado por la acción de ROS. Así lo afirma la “Teoría mitocondrial del envejecimiento” cuyo defensor principal fue el grupo de J. Miquel que en 1991 proporcionó el apoyo experimental, al integrar el agente agresivo (ROS) y el objetivo del daño (ADN mitocondrial (ADNmt) de manera que “la importancia de esta teoría prevalece cuando el proceso de producción del ROS / daño a ROS se establece como un proceso único” La Teoría del Envejecimiento Radical Libre Mitocondrial propone esencialmente una degeneración acelerada exponencial de las mitocondrias (26), apuntando a esta como la fuente principal de ROS e igualmente el objetivo primario del daño de ROS. Pese a que el EO, el estrés del metabolito y el hidrolítico se reconocen como implicados en los fenómenos de mortalidad la naturaleza molecular de los mismos permanece incierta habiéndose propuesto más de 300 teorías intentando resolver las incógnitas del envejecimiento. No obstante, desde el momento en que se planteó la teoría de los radicales libres, una creciente cantidad de evidencia apuntó al EO como el factor principal del envejecimiento por su contribución al desarrollo de múltiples procesos patológicos dependientes de la edad. Por lo tanto, el EO, refleja una situación de desequilibrio entre los procesos de oxidación espontánea inducida por un aumento en la producción de ROS y la efectividad de los sistemas antioxidantes. En estas condiciones, una vez superada la barrera antioxidante, las especies reactivas difunden a través de los distintos compartimentos celulares e interaccionan libremente con un número muy variado de biomoléculas orgánicas a las que modifican oxidativamente primero para inducir la pérdida de su función biológica después. Esta modificación oxidativa es resultado del secuestro electrónico al que se ven sometidas por las especies paramagnéticas en un intento de aparear su electrón desapareado. Para medir la evolución del EO durante el envejecimiento y cómo varia el metabolismo celular, se han propuesto varios biomarcadores que incluirían productos de peroxidación lipídica (LPO), de oxidación de proteínas, enzimas de acción antioxidante, minerales, vitaminas, glutatión, flavonoides, bilirrubina y ácido úrico entre otros, pero ninguno podría ser considerado como único e idóneo para determinar la esperanza de vida de la persona individual, su edad biológica o el estado de salud relacionado con la edad. Además, hay muchos datos contradictorios sobre los cambios de cada biomarcador individual y no es posible utilizar solo un marcador para determinar el estado de salud ni predecir la esperanza de vida. Entre ellos, se ha propuesto incluir al menos un marcador de LPO, de oxidación de la proteína y del estado antioxidativo total, e idealmente también uno para los daños en el ADN. Hacer una revisión exhaustiva y completa de todos estos metabolitos y productos de oxidación como candidatos para valorar el estado biológico y su valor como marcadores del envejecimiento sería una labor más allá del objetivo de esa introducción, por lo que nos centraremos en aquellos que han mostrado ser los más relevantes. La modificación oxidativa de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos son aspectos muy relevantes dentro de las interacciones moleculares de los ROS y las consecuencias biopatológicas del EO debido a la gran cantidad de estudios que señalan que el estrés oxidativo subyace e interviene en la evolución de las complicaciones patogénicas de todas y cada uno de los procesos degenerativos propios de la edad avanzada. De esta manera, queda por ver si el grado de estrés es de la misma intensidad en todos los individuos dentro de una misma franja de edad y que consecuencias o beneficios puede tener para aquellos seres más longevos. Las especies reactivas en general y los ROS en particular, en condiciones fisiológicas o controladas desempeñan funciones de regulación homeostática muy importantes para las células. Por su importancia como marcador de EO e implicaciones fisiopatológicas, los productos de oxidación de los ácidos nucleicos ocupan un papel destacado como posibles marcadores biológicos del envejecimiento. De ellos, la 8-oxo-dG se destaca como metabolito prominente. Por otra parte, la actividad y expresión de enzimas antioxidantes también han sido objeto de profundas investigaciones, si bien los resultados obtenidos difieren dependiendo del tipo de estudio y aproximación experimental utilizada. Tampoco está definida la autoría y utilidad de estos marcadores, productos de oxidación y/o moléculas antioxidantes, como analitos individuales o más bien en su conjunto, cuántos y cuáles. En cuanto a la relación existente entre actividad física y el EO existe cierta controversia entre los resultados obtenidos y las conclusiones a las que llegan los distintos grupos. El ejercicio físico induce la formación de ROS con una intensidad que parece depender del tipo de actividad y las características de los sujetos que lo practican. Sin embargo, su práctica parece ser beneficiosa en muchos aspectos e incluso se ha sugerido que aumenta la longevidad de algunas especies y líneas celulares. El ejercicio físico permite el desarrollo y la implementación de la función vital. Se han planteado varias hipótesis de cómo la actividad física puede mejorar la progresión del envejecimiento y se ha comunicado que la duración de la vida puede incrementar en dos años cuando se practica ejercicio físico. Sin embargo, la contradicción es obvia, en base al concepto de que el ejercicio físico aumenta el estrés oxidativo como otras proteínas de fase reactiva aguda y marcadores de inflamación. Se ha alegado que el ejercicio promueve tanto la producción de radicales libres como la peroxidación lipídica. Incluso el ejercicio físico regular, que se ha demostrado que aumenta la vida media, también se considera un factor estresante HIPÓTESIS DE TRABAJO El envejecimiento se caracteriza y está asociado a un aumento de las oxidaciones moleculares por el EO que resulta del desequilibrio entre procesos que generan especies reactivas de oxígeno y la actividad de los sistemas antioxidantes. El EO está estrechamente relacionado con la fisiopatología y complicaciones patogénicas de gran parte de los procesos degenerativos del envejecimiento. Sin embargo, no se han establecido los niveles de productos de oxidación ni antioxidantes en sujetos sanos a lo largo de sus distintas etapas desde la madurez. Esta información es de gran importancia para poder conocer la edad biológica de las personas y, ante sus modificaciones, poder predecir la aparición de alteraciones. El EO se ha relacionado con situaciones que cursan con un aumento del consumo de oxígeno. En este sentido el ejercicio físico, altamente recomendado para prevenir enfermedades cardiovasculares, metabólicas, osteoarticulares e incluso tumorales, se ha relacionado con la formación de especies reactivas de oxígeno y por ello con el EO, siendo este un aspecto de controversia a la hora de recomendar la práctica de actividad física tanto en personas jóvenes como en adultos mayores. Por tanto, todo parece indicar que el grado de EO y sus efectos deletéreos durante el ejercicio depende del tipo de ejercicio realizado, de la edad y del grado de entrenamiento de la persona que lo practica. OBJETIVOS 1. Valoración de los niveles sistémicos de estrés oxidativo (EO) en personas adultas sanas de edades comprendidas entre los 18 y los 90 años. 2. Cuantificar los efectos del entrenamiento físico controlado sobre el rendimiento de los sujetos y los niveles de EO en mujeres adultas mayores. MATERIAL Y MÉTODOS Para abordar los objetivos experimentales planteados se ha subdivido a la población en dos grupos de sujetos voluntarios. El primer grupo (120 individuos, hombres y mujeres con edades comprendidas entre 18 y 90 años) corresponde al estudio de la valoración de los cambios de parámetros oxidativos en distintas edades. El grupo se subdividió en tres grupos según la edad: Grupo A: 18 a 40 años, B: 41 a 60 años y C: 61 a 90 años. El segundo grupo corresponde al estudio de entrenamiento controlado sobre parámetros de función física y de estrés oxidativo para lo que se seleccionó un grupo de mujeres mayores sanas, con edades comprendidas entre 60 y 75 años, a las que se les entrenó mediante ejercicio de fuerza con resistencia variable desarrollado a diferentes intensidades. Para la medida de la función física se evaluó mediante las siguientes pruebas estandarizadas de la batería Rikli y Jones: “30-Second Arm Curl Test” (Arm Curl), “30-Second Chair Stand Test” (Chair Stand), “Eight-Foot Up and Go Test” (TUG) y “Six Minute Walking Test” (6MWT). El programa de intervención supervisada incluyó 2 sesiones semanales de 55 minutos a 1 hora realizadas en días no consecutivos (separados por 48 horas) durante 16 semanas. Cada sesión se realizó en un grupo, y cada participante siempre realizó los ejercicios en el mismo orden, alternando entre las extremidades superiores e inferiores. Se usaron bandas elásticas (TheraBand®, Akron, OH, EE. UU.) y sillas como material de trabajo. Durante el periodo de entrenamiento el grupo ALTO realizó seis repeticiones submáximas, con una carga cercana al 85% del máximo movilizado para una sola repetición (1RM) por ejercicio, mientras que el grupo MOD realizó 15 repeticiones submáximas, con una carga equivalente al 70% de 1RM. El análisis de los metabolitos de EO se realizó por procedimientos estandarizados. Las actividades de superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPx) y los niveles de glutatión se analizaron por el método de espectrofotometría siguiendo los respectivos procedimientos de kits de ensayo de Cayman Chemical. La actividad de la capacidad antioxidante del plasma (PAO) y proteínas carboniladas se analizó por el método de ELISA siguiendo el protocolo del kit de ensayo de Cayman Chemical respectivo. La determinación de malonildialdehido (MDA) en células mononucleares circulantes (CMNs) por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC-UV). Los niveles de F2-8-isoprostanos (F2-IsoP) en la orina se cuantificaron siguiendo las especificaciones analíticas del ensayo ELISA de Cayman. En cuanto a las determinaciones de 8 oxo-7,8-dihidrodesoxiguanosina (8-oxo-dG) en ADN genómico procedente de CMNc, suero y orina se realizaron por separación y cuantificación por HPLC-EC siguiendo los métodos descritos por Muñiz y Espinosa. RESULTADOS Existe una tendencia a la disminución de actividades en las tres enzimas antioxidantes estudiadas y en la capacidad total del plasma si bien la intensidad de estas disminuciones es diferente dependiendo de tipo del parámetro antioxidante analizado. La actividad SOD disminuyó en el grupo de adultos entre 41 y 60 años en un 3% no siendo esta diferencia estadísticamente significativa. Sin embargo, en el grupo C (de mayor edad), los valores de SOD, en las células mononucleares circulantes, representa un 8% menos respecto al grupo A (de 18 y 40 años) y alcanza significancia estadística (p<0,05). La actividad de enzima catalasa presenta una disminución más marcada conforme avanza la edad respecto a lo observado con las actividades anteriores. En el grupo de sujetos más jóvenes, esta actividad disminuye un 12% en el grupo B y un 24% en el C con un valor estadístico de p<0,001 pasando de 270 U/g.prot a 238 U/g.prot y 205 U/g.prot respectivamente. También en este caso existe diferencia significativa (p<0,001) al comparar el grupo B con el C. La capacidad antioxidante total del plasma disminuye progresivamente con la edad, disminuyendo en un 7% en el grupo B y u 22% en el C con relación a la población de menor edad (Grupo A) (p<0,001). Existe diferencia entre los grupos B y C (p<0,001) con tendencia a la disminución de la defensa antioxidante total a medida que se avanza en edad. El antioxidante GSH tiende a disminuir en los grupos de mayor edad (B y C) con respecto al grupo de menor edad (A), con muy discreta disminución en el primer caso y más marcada y significativa (p<0,001) en el segundo, con un porcentaje de disminución del 10%. Esta disminución corresponde con un aumento progresivo de su producto oxidado GSSG. La actividad GPx sigue una tendencia similar, con descenso del 4% y 7% con respecto al valor del grupo A en los sujetos adultos más mayores, grupos B y C respectivamente. En este caso las diferencias estadísticas se observan ya en el grupo de sujetos entre 41 y 60 años (Grupo B) (p<0,05) y ésta aumenta en los sujetos de edad más avanzada (Grupo C) (p<0,001). También existe una diferencia significativa entre el grupo B y C (p<0,001) indicando que la actividad de esta enzima se reduce todavía más en el grupo de edad comprendida entre 61 y 90 años. Correspondiendo con la disminución de actividades antioxidantes se observa, como resultado un aumento de los productos de oxidación de lípidos en las CMNc. El MDA aumenta a medida que avanza la edad así como los F2-IsoP. Respecto a las proteínas, su marcador de oxidación por ROS más específico, los grupos carbonilos o proteínas carboniladas sigue una tendencia parecida al aumentar ligeramente con relación al grupo A de sujetos más jóvenes, hasta ser significativo en las personas de mayor edad (Grupo C). Para la valoración de la oxidación del ADN se cuantificó la cantidad del producto de oxidación, 8-oxo-dG, tanto in situ, es decir, la proporción de esta base oxidada en la cadena de ADN nuclear extraído de CMNc, como su producto de reparación liberado en suero y en orina. La oxidación del ADN genómico en las células circulantes aumenta en los grupos de mayor edad con respecto a los sujetos más jóvenes. En el grupo GC los niveles de 8-oxo-dG en orina fueron 2.75+/-1.30nmoles/mmol creatinina y las concentraciones de GSH y GSSG en CMNc de 22.46+/-2.67 y 0.23+/-0.10 nmol/mg proteína respectivamente (relación GSSG/GSH de 1.08%+/-0.59 En el grupo AI se observó un incremento significativo (p=0.010) en la eliminación urinaria de 8-oxo-dG (+71.07%) con un tamaño del efecto (TE) grande= 1.12, acompañado de una disminución significativa (p=0.002) del antioxidante GSH (-10.91%, ET=-0.69. En el grupo MI se produjo una disminución significativa (p=0.033) de la 8-oxo-dG en orina del -25.66% con un TE moderado (-0.69), sin observase cambios en los niveles intracelulares de GSH, encontrándose diferencias significativas entre el grupo AI y GC tras el entrenamiento (p=0.048). No se observaron diferencias en los niveles intracelulares de GSSG ni de la relación GSSG/GSH inducidos por la intervención física en ninguno de los grupos estudiados. CONCLUSIONES 1. El análisis de los niveles de antioxidantes en una población sana de edad comprendida entre los 18 a 40 años, 41 a 60 y 61 a 90 años demuestra la disminución de las enzimas SOD, Catalasa y GPx así como el PAO de forma progresiva, existiendo diferencias significativas entre los tres grupos de edad estudiados. 2. Los niveles del antioxidante GSH disminuyen progresivamente y de forma proporcional con la edad de la población mientras que su producto de oxidación GSSG y la relación GSSG/GSH aumentan, siendo significativos los cambios encontrados al comparar el grupo de mayor con el de menor edad. Lo que demuestra un mayor grado de oxidación sistémica en las personas adultas mayores de 60 a 90 años, comparado con los adultos jóvenes de 18 a 40 años. 3. Los productos de peroxidación lipídica MDA y F2-isoprostanos también aumentan progresivamente a medida que se avanza en edad con diferencias que solo son significativas al comparar el grupo de 61 a 90 años, con el de 18 a 40 años. 4. La oxidación de proteínas, cuantificado por la concentración sérica de grupos carbonilo experimenta un aumento progresivo, con diferencia significativa entre los grupo de 61 a 90 años y el de 18 a 40 años. 5. A medida que transcurre la edad aumenta el grado de lesión oxidativa del ADN medido por los niveles de 8-oxo-dG genómico de las células mononucleares circulantes. Este aumento se acompaña también de niveles progresivamente más elevados de 8-oxo-dG tanto en el suero como en la orina de los sujetos incluidos en el estudio, con diferencias significativas entre los tres grupos de edad. Este resultado sugiere que si bien existe un mayor grado de lesión del material genético con la edad, la actividad de los sistemas de reparación se conserva en las personas mayores que no presentan patologías ni comorbilidades asociadas al envejecimiento. 6. Existe una correlación estadísticamente significativa entre los niveles en orina de F2-IP y 8-oxo-dG, y ambos metabolitos correlacionan significativamente con la concentración intracelular de GSH, y la relación GSSG/GSH. 7. Los niveles de 8-oxo-dG en orina correlacionan negativamente y de forma significativamente con la actividad intracelular de la enzima GPx. 8. Los niveles de F2-IP y 8-oxo-dG eliminados por la orina así como las concentraciones intracelulares de GSH, GSSG, relación GSSG/GSH y actividad GPx correlacionan con niveles diferentes de significativa estadística con la edad de los sujetos estudiados y apuntan hacia su utilidad como marcadores biológicos del envejecimiento poblacional. 9. Nuestros resultados muestran que el programa de entrenamiento de la fuerza con resistencia progresiva (bandas elásticas) de 16 semanas en sesiones de ejercicio de dos veces por semana, desarrollado con un carácter del esfuerzo de 8-9 sobre 10 al final de cada serie y aplicado con una intensidad o resistencia moderada para un total de 15 repeticiones puede mejorar el estrés oxidativo al disminuir el daño del ADN en mujeres mayores sanas. Sin embargo se pudo observar el efecto contrario cuando un entrenamiento similar de la fuerza (mismo tipo de ejercicios, velocidad de ejecución y carácter del esfuerzo) se desarrolla con una intensidad más alta, es decir, mayor resistencia empleada para un total de 6 repeticiones. 10. El entrenamiento de la fuerza con alta intensidad (6 repeticiones) induce una disminución significativa en GSH, mientras que los niveles de este antioxidante no se ven afectados tras el ejercicio de fuerza de intensidad moderada (15 repeticiones), lo que confirma mejores resultados en la prevención del estrés oxidativo. 11. Las mejoras en la función física observadas tras el periodo de entrenamiento de la fuerza se producen independientemente de la intensidad/resistencia empleada. Por lo tanto, la implementación de un protocolo de entrenamiento de la fuerza con un nivel de intensidad moderado (15 repeticiones) puede ser la mejor estrategia para reducir el daño en el ADN y conseguir una mayor independencia física de las mujeres mayores. 12. Estos marcadores de estrés oxidativo pueden ser útiles como herramienta no invasiva y de bajo coste (ensayo de 8-oxo-dG en orina) para valorar el estrés oxidativo y la dinapenia en mujeres mayores, sabiendo, además, que los dispositivos elásticos empleados para aplicar el entrenamiento de la fuerza también son sumamente de fácil acceso y uso además de económicos.